البيولوجيا والتطوّر > ألبـومـات
شرح مُبسَّط لتقنية الــPCR خطوة بخطوة
حدث تطوير Kary Mullis لتقنية (polymerase chain reaction (PCR (تفاعل البوليمراز المتسلسل)عام 1983 ثورةً في مجال البيولوجيا الجزيئية؛ ممَّا أدى إلى ظهور عديدٍ من التقنيات المفيدة التي تسمح بتحليل الأحماض النووية المختلفة. (1)
إنَّ تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي بتنا نسمع عنه كثيرًا في الآونة الأخيرة بوصفه اختبارًا تشخيصيًّا لمرض COVID-19 يعدُّ تقنيةً لكشف الأحماض النووية وقياسها وتضخيمها.
ويهدف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تشكيل ملايين النُّسخ من جزيئات الــDNA المتطابقة والمُطابِقة لقالب الــDNA الأساسي؛ ممَّا يُضاعف العينة الأصلية مع كل دورة من التفاعل، ولكن؛ كيف ذلك؟ علينا ألا ننسى أنَّ الــDNA سلسلتان مكمِّلتان لبعضهما، ومبدأ التفاعل ببساطة هو فصل هاتين السلسلتين، ونَسْخ سلسلة مكمِّلة لكلٍّ منهما على حدة؛ لنحصل في النهاية على نسختين من الــDNA الأصل، وبتكرار التفاعل عدَّة مرات نحصل على ملايين النُّسخ.
ويُحلَّل بعد ذلك الحمض النووي المُضخم نوعيًّا (تحرِّي وجوده)، أو كميًّا (تحديد كميته) أو بالتتابع (تحديد رمزه الجيني)، ويُستخدم في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية المختلفة. (1،2)
يحتاج التفاعل إلى عدَّة مكونات لإتمام عملية بناء جزيئة DNA جديدة (أو جزء منها) وهي: (1،4)
أولًا قالب DNA رئيس يُراد تضخيمه بعد استخراجه من عينة الدم أو اللعاب أو غير ذلك.
ثانيًا "أحجار البناء الرئيسة" للــDNA: وتُدعى نكليوتيدات.
ثالثًا زوج البادئات (primers): وهي حجر الأساس الذي تُبنى انطلاقًا منه بقية الأحجار، وتتألف من تسلسلٍ قصير من النكليوتيدات مُكمِّلٍ للتسلسل المُستهدَف على قالب الــDNA؛ إذ يرتبط زوج البادئات عند بداية المنطقة المُراد تضخيمها ونهايتها.
رابعًا عامل البناء: وهو أنزيم (DNA polymerase) بوليميراز: مهمَّته بناء تسلسل الــDNA برصف الأحجار(النكليوتيدات) في مكانها الصحيح ابتداءً من البادئات.
خامسًا العوامل المساعدة: كالمغنيزيوم (Mg+2) ومحلول موقي (يحافظ على درجة حموضة معينة للوسط)؛ وذلك لزيادة كفاءة التفاعل.
يُقسم تفاعل الــPCR الأساسي إلى ثلاث مراحل عامة: التمسيخ والالتصاق والإطالة، ولكلٍّ منها درجة حرارة معينة وزمن معين مناسبين للهدف المُنتَظر منها (1،5)، وكل مرحلة من هذه المراحل موضَّحة بالشكل المُرفق معها.
التمسيخ أو التفكُّك (denaturation): لكي تُنتَسخ سلسلتا الــDNA المتطابقتين يجب فصلهما عن بعضهما أولًا، وذلك بكسر روابط الهيدروجين بين السلسلتين، وتحتاج هذه المرحلة إلى درجة حرارة 94-98 درجة مئوية، وتستغرق قرابة دقيقتين.
الالتصاق (annealing): في هذه الخطوة، ترتبط البادئات بالتسلسل المُكمِّل لها على قالب الــDNA المُتمسِّخ على النحو الموضح بالصُّورة، وتحتاج هذه المرحلة إلى 52-58 درجة مئوية مدة 15-60 ثانية.
الإطالة (elongation) المرحلة النهائية التي تتطلَّب درجة حرارة (70-80 درجة مئوية) تسمح بالفعالية المُثلى لأنزيم البوليميراز مدة دقيقة أو أكثر حسب طول المنطقة المُراد تضخيمها، وفي النهاية تكون لدينا نسختان من الــDNA يحتوي كلٌّ منهما على سلسلة من القالب الأصلي وسلسلة جديدة مُكمِّلة لكلٍّ منهما.
طُوِّرت هذه التقنية لتُلائم تطبيقات البيولوجيا الجزيئية المختلفة فمثلًا؛ يمكن إجراء اختبار على عينة RNA عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل ذي النَّسخ العكسي (Reverse transcriptase PCR)، وهي التقنية المُستخدمة للكشف عن فيروسات عديدة (6).
ويحدث هذا التفاعل عادةً بمراحله جميعها داخل جهاز يُسمَّى المدوِّر الحراري (thermocycler)، ويحتوي على أماكن مخصَّصة للعينات، ويُبرمَج للتحكُّم بدرجات الحرارة والزمن المناسبين لكل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه (1،7).
تهانينا! لقد أصبحت الآن على اطلاع بإحدى أهم تقنيات علم البيولوجيا الجزيئية! ولمزيد من التوضيح، انظر إلى رابط فيديو توضيحي للتقنية في المرجع رقم (8).
المصادر:
2- polymerase chain reaction / PCR | Learn Science at Scitable [Internet]. Nature.com. 2020 [cited 1 June 2020]. Available from: هنا
3- Bej A, Mahbubani M, Atlas R. Amplification of Nucleic Acids by Polymerase Chain Reaction (PCR) and Other Methods and their Applications. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1991;26(3-4):301-334.
4- Crowther J, Nel L, Viljoen G. Molecular Diagnostic PCR Handbook. [New York]: IAEA; 2005.
5- Garibyan L, Avashia N. Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative Dermatology. 2013;133(3):1-4.
6- Pelt-verkuil E, Belkum A, Hays J. Technical Aspects and Principles of PCR Amplification. Dordrecht: Springer; 2008.
7- Benett et al. PCR Thermocycler. 2003.
8- هنا